Structural and functional characterization of the lysosomal amino acid transporter PQLC2
Caractérisation structurelle et fonctionnelle du transporteur lysosomal d'acides aminés PQLC2
Résumé
PQLC2, which stands for proline-glu- tamine loop repeat-containing protein 2, be- longs to a family of membrane transport pro- teins characterized by a seven-helix membrane topology and two proline-glutamine motifs. PQLC2 is localized in the lysosomal membrane of mammalian cells, and studies using recombi- nant PQLC2 expressed in Xenopus oocytes have demonstrated that PQLC2 is an uniporter that specifically transports cationic amino acids. However, its 3D atomic structure has not yet been determined. In addition to being a trans- porter, PQLC2 is also a membrane receptor. When the cell is deprived of cationic amino acids, PQLC2 recruits at the lysosome surface a complex of three proteins (called CSW): the GTPase-activating proteins C9ORF72 and SMCR8, and WDR41, the anchor between CSW and PQLC2. The CSW complex is important for normal lysosome function. In addition, congeni- tal mutations in the gene encoding C9ORF72 are directly associated with two neurodegene- rative diseases. Pull-down assays in cell extracts indicate that the interaction of a short 10 amino acid peptide motif from a protruding loop of WDR41 (WDR41-7CD loop) with PQLC2 is sufficient for lysosomal recruitment of CSW. To characterize this interaction as well as the functional role of PQLC2, we expressed mammalian PQLC2 in the yeast Saccharomyces cerevisiae, and established a purification protocol of PQLC2 based on the recognition between anti-GFP nanobodies and GFP fused to PQLC2. To improve the stability of detergent-purified PQLC2, we introduced speci- fic mutations along the protein sequence using a consensus-based mutagenesis approach. Ne- gative-staining electron microscopy of deter- gent-purified PQLC2 suggests that this trans- porter assembles as a homotrimer, like other members of the same PQ-loop family of trans- porters. Finally, by electron paramagnetic re- sonance (EPR) spectroscopy, we assessed the direct interaction between PQLC2 and a peptide encoding the WDR41 loop. These experiments revealed the role of certain WDR41 loop resi- dues in the PQLC2/WDR41-7CD loop interac- tion, as well as the effect of a PQLC2 substrate.
PQLC2, qui signifie protéine conte- nant des répétitions de boucle proline-gluta- mine 2, appartient à une famille de protéines de transport membranaires caractérisées par une topologie membranaire à sept hélices et deux motifs proline-glutamine. PQLC2 est localisé dans la membrane lysosomale des cellules mammifères, et des études utilisant du PQLC2 recombinant exprimé dans des ovocytes de Xe- nopus ont démontré que PQLC2 est un unipor- teur qui transporte spécifiquement des acides aminés cationiques. Cependant, sa structure atomique en 3D n’a pas encore été déterminée. En plus de son rôle de transporteur, PQLC2 est également un récepteur membranaire. Lorsque la cellule est privée d’acides aminés cationiques, PQLC2 recrute à la surface du lysosome un com- plexe de trois protéines (appelé CSW) : les pro- téines GTPas-activatrices C9ORF72 et SMCR8, et WDR41, l'ancrage entre CSW et PQLC2. Le com- plexe CSW est important pour le bon fonction- nement des lysosomes. De plus, des mutations congénitales dans le gène codant pour C9ORF72 sont directement associées à deux maladies neurodégénératives. Des essais de pull-down dans des extraits cellu- laires indiquent que l’interaction d’un court mo- tif peptidique de 10 acides aminés provenant d’une boucle saillante de WDR41 (boucle WDR41-7CD) avec PQLC2 est suffisante pour le recrutement lysosomique de CSW. Afin de ca- ractériser cette interaction ainsi que le rôle fonc- tionnel de PQLC2, nous avons exprimé PQLC2 de mammifère dans la levure Saccharomyces cerevisiae et établi un protocole de purification de PQLC2 basé sur la reconnaissance entre des nanocorps anti-GFP et GFP fusionné à PQLC2. Pour améliorer la stabilité de PQLC2 purifié par détergent, nous avons introduit des mutations spécifiques le long de la séquence de la pro- téine en utilisant une approche de mutagenèse basée sur un consensus. La microscopie électro- nique à contraste négatif de PQLC2 purifié par détergent suggère que ce transporteur s’as- semble sous forme d’homotrimère, comme les autres membres de la même famille de trans- porteurs à boucle PQ. Enfin, par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE), nous avons évalué l’interaction directe entre PQLC2 et un peptide codant la boucle WDR41. Ces expériences ont révélé le rôle de certains résidus de la boucle WDR41 dans l’in- teraction PQLC2/boucle WDR41-7CD, ainsi que l’effet d’un substrat de PQLC2.
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